Kimia Klinik

SPEKTROFOTOMETER: PENGERTIAN, PRINSIP KERJA, KOMPONEN, METODE PEMERIKSAAN, DAN PENERAPANNYA DI LABORATORIUM

24 Oktober 2026 · Tim PT Rejeki Prima Anugerah

Abstrak

Spektrofotometer merupakan instrumen laboratorium yang digunakan untuk mengukur intensitas cahaya yang diserap atau diteruskan oleh suatu sampel pada panjang gelombang tertentu. Instrumen ini banyak digunakan dalam bidang kimia, farmasi, biologi, industri, penelitian, serta laboratorium kesehatan. Dalam pemeriksaan laboratorium klinik, prinsip spektrofotometri menjadi salah satu dasar penting pada pemeriksaan kimia klinik untuk mengukur konsentrasi berbagai zat dalam sampel biologis, seperti glukosa, kolesterol, trigliserida, kreatinin, bilirubin, dan protein. Pengukuran dilakukan dengan memanfaatkan interaksi antara cahaya dan zat yang diperiksa, kemudian hasil pengukuran diolah menjadi nilai absorbansi atau konsentrasi. Keakuratan hasil pemeriksaan dipengaruhi oleh berbagai faktor, antara lain ketepatan panjang gelombang, kondisi sumber cahaya, kebersihan kuvet, karakteristik sampel, kondisi reagen, serta kalibrasi dan pemeliharaan alat. Oleh karena itu, pemahaman mengenai prinsip kerja, komponen, metode pemeriksaan, dan pengendalian mutu spektrofotometer sangat penting untuk memperoleh hasil pengukuran yang akurat dan dapat diandalkan.

Kata kunci: spektrofotometer, spektrofotometri, absorbansi, transmitansi, hukum Lambert-Beer, kimia klinik, laboratorium medis.

1. Pendahuluan

Perkembangan teknologi laboratorium telah memungkinkan berbagai pemeriksaan dilakukan dengan lebih cepat, teliti, dan efisien. Salah satu teknologi yang banyak digunakan dalam proses analisis kimia adalah spektrofotometri. Teknologi ini memanfaatkan cahaya sebagai media untuk mengetahui karakteristik suatu zat, baik untuk membantu identifikasi maupun menentukan konsentrasinya.

Alat yang digunakan untuk melakukan pengukuran tersebut disebut spektrofotometer. Dalam pengoperasiannya, alat menghasilkan atau menggunakan sumber cahaya, memilih panjang gelombang tertentu, mengarahkan cahaya melewati sampel, dan mengukur intensitas cahaya yang diterima detektor. Perbedaan intensitas cahaya sebelum dan sesudah melewati sampel digunakan untuk menghitung nilai absorbansi atau parameter optik lainnya.

Dalam laboratorium kesehatan, prinsip fotometri dan spektrofotometri banyak digunakan oleh chemistry analyzer atau alat kimia klinik otomatis. Reaksi antara sampel dengan reagen dapat menghasilkan perubahan warna atau perubahan penyerapan cahaya. Besarnya perubahan tersebut digunakan untuk menentukan kadar analit yang diperiksa.

Namun, perlu dipahami bahwa spektrofotometer mandiri dan chemistry analyzer bukanlah alat yang sepenuhnya sama. Spektrofotometer umumnya berfungsi untuk mengukur karakteristik optik sampel, sedangkan chemistry analyzer mengintegrasikan sistem optik dengan sistem penanganan sampel, penambahan reagen, pengaturan suhu, pengolahan data, dan proses pemeriksaan otomatis.

2. Pengertian Spektrofotometer

Spektrofotometer adalah alat analisis yang mengukur interaksi antara radiasi elektromagnetik dan suatu bahan berdasarkan panjang gelombang tertentu. Pengukuran dapat dilakukan dengan menilai banyaknya cahaya yang diserap, diteruskan, atau dalam metode tertentu dipantulkan oleh sampel.

Pada spektrofotometer serapan, pengukuran umumnya dilakukan dengan membandingkan intensitas cahaya yang datang dengan intensitas cahaya yang diteruskan setelah melewati sampel.

Secara sederhana, prinsipnya dapat dijelaskan sebagai berikut:

Alat menghasilkan cahaya.

Cahaya dipilih pada panjang gelombang tertentu.

Cahaya dilewatkan melalui sampel.

Sebagian cahaya diserap oleh zat dalam sampel, sedangkan sisanya diteruskan.

Detektor mengukur cahaya yang diteruskan.

Sistem elektronik menghitung nilai absorbansi dan, bila metode mendukung, konsentrasi zat dalam sampel.

Spektrofotometri serapan ultraviolet dan cahaya tampak merupakan salah satu metode yang banyak digunakan untuk analisis kuantitatif. Informasi mengenai prinsip tersebut juga dijelaskan dalam Farmakope Kementerian Kesehatan Republik Indonesia.

3. Prinsip Kerja Spektrofotometer

3.1 Prinsip dasar penyerapan cahaya

Setiap zat memiliki karakteristik interaksi yang berbeda terhadap cahaya. Ketika cahaya dengan panjang gelombang tertentu melewati suatu larutan, sebagian energi cahaya dapat diserap oleh molekul atau ion dalam larutan tersebut.

Pada spektrofotometri UV-Vis, penyerapan energi pada daerah ultraviolet dan cahaya tampak berkaitan dengan perubahan keadaan energi elektron dalam molekul. Besarnya penyerapan pada panjang gelombang tertentu dapat digunakan untuk mengenali karakteristik suatu zat atau menghitung konsentrasinya, apabila metode analisisnya sesuai.

Misalnya, suatu sampel yang bereaksi dengan reagen membentuk senyawa berwarna. Semakin banyak senyawa berwarna yang terbentuk, semakin besar cahaya yang dapat diserap pada panjang gelombang yang sesuai, selama pengukuran masih berada dalam rentang linear metode tersebut.

Perlu diperhatikan bahwa hubungan antara konsentrasi dan absorbansi tidak selalu linear pada semua kondisi. Konsentrasi yang terlalu tinggi, gangguan matriks, reaksi yang tidak sempurna, atau keterbatasan instrumen dapat menyebabkan penyimpangan.

3.2 Hukum Lambert-Beer

Dasar kuantitatif spektrofotometri serapan adalah hukum Lambert-Beer atau hukum Beer-Lambert. Hukum ini menjelaskan hubungan antara absorbansi, konsentrasi zat penyerap, dan panjang lintasan cahaya di dalam sampel.

Rumusnya adalah:

A = ε × b × c

Keterangan:

A = absorbansi, tanpa satuan.

ε = absorptivitas molar, yang bergantung pada zat dan panjang gelombang, umumnya dinyatakan dalam L·mol⁻¹·cm⁻¹.

b = panjang lintasan optik melalui sampel, biasanya dalam cm.

c = konsentrasi zat, dalam mol/L apabila menggunakan absorptivitas molar.

Apabila jenis zat, panjang gelombang, dan panjang lintasan optik tetap, absorbansi berbanding lurus dengan konsentrasi zat selama sistem memenuhi kondisi hukum Beer-Lambert.

Artinya, dalam rentang kerja yang sesuai, kenaikan konsentrasi akan diikuti kenaikan absorbansi.

Sebagai contoh, jika konsentrasi suatu zat meningkat dua kali lipat, absorbansinya secara ideal juga dapat meningkat dua kali lipat. Hubungan ini berlaku selama tidak terjadi penyimpangan akibat konsentrasi tinggi, reaksi kimia, hamburan cahaya, atau keterbatasan instrumen.

Penjelasan hukum Lambert-Beer dan penggunaannya dalam pengukuran kuantitatif dapat ditemukan pada Farmakope Kementerian Kesehatan RI dan referensi Merck mengenai spektrofotometri UV-Vis.

3.3 Absorbansi dan transmitansi

Dua istilah utama dalam spektrofotometri adalah absorbansi dan transmitansi.

a. Absorbansi (Absorbance)

Absorbansi menunjukkan besarnya penyerapan cahaya oleh sampel. Nilai absorbansi yang lebih tinggi berarti lebih sedikit cahaya yang diteruskan pada kondisi pengukuran yang sama.

Rumus:

A = log₁₀(I₀/I)

b. Transmitansi (Transmittance)

Transmitansi merupakan perbandingan antara intensitas cahaya yang diteruskan sampel dengan intensitas cahaya yang datang.

Rumus:

T = I/I₀

Persentase transmitansi dihitung dengan:

%T = T × 100%

Keterangan:

I₀ = intensitas cahaya sebelum melewati sampel.

I = intensitas cahaya setelah melewati sampel.

T = transmitansi.

Sebagai contoh, jika intensitas cahaya awal adalah 100 satuan dan cahaya yang diteruskan hanya 25 satuan, maka transmitansinya adalah 25%. Absorbansinya adalah log₁₀(100/25), yaitu sekitar 0,602.

Contoh tersebut menunjukkan bahwa absorbansi dan transmitansi memiliki hubungan berlawanan: ketika transmitansi menurun, absorbansi meningkat.

3.4 Panjang gelombang maksimum (λmaks)

Panjang gelombang maksimum atau λmaks adalah panjang gelombang ketika suatu zat menunjukkan absorbansi maksimum dalam spektrum serapannya pada kondisi pengukuran tertentu.

Pemilihan λmaks sering dilakukan karena zat memberikan respons penyerapan yang relatif tinggi pada panjang gelombang tersebut. Hal ini dapat meningkatkan sensitivitas pengukuran dan, dalam kondisi yang sesuai, membantu mengurangi pengaruh kesalahan kecil pada pengaturan panjang gelombang.

Walaupun demikian, panjang gelombang maksimum tidak boleh ditentukan secara sembarangan. Pada pemeriksaan rutin laboratorium, panjang gelombang harus mengikuti metode tervalidasi, petunjuk reagen, atau prosedur pemeriksaan yang digunakan.

4. Jenis-Jenis Spektrofotometer

Spektrofotometer dapat dibedakan berdasarkan daerah panjang gelombang yang digunakan, desain sistem optik, dan cara pengukurannya.

4.1 Berdasarkan daerah panjang gelombang

a. Spektrofotometer ultraviolet (UV)

Instrumen ini digunakan untuk mengukur penyerapan radiasi ultraviolet. Secara umum, daerah UV berada sekitar 190–380 nm, meskipun batas yang digunakan dapat berbeda menurut standar dan desain alat.

Penggunaannya antara lain untuk analisis senyawa yang menyerap UV, pengukuran asam nukleat dan protein pada metode tertentu, serta pemantauan reaksi biokimia menggunakan NADH atau NADPH.

Kuvet kuarsa umumnya digunakan pada pengukuran UV karena bahan ini dapat meneruskan radiasi ultraviolet dengan baik pada rentang yang sesuai.

b. Spektrofotometer cahaya tampak (Visible)

Spektrofotometer visible mengukur penyerapan cahaya tampak, yang secara umum berada sekitar 380–780 nm.

Metode ini banyak digunakan untuk larutan berwarna atau untuk pemeriksaan yang menghasilkan senyawa berwarna setelah sampel bereaksi dengan reagen.

c. Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis dapat mengukur sampel pada rentang ultraviolet dan cahaya tampak sesuai spesifikasi alatnya.

Instrumen ini banyak digunakan di laboratorium kimia, farmasi, penelitian biologi, pengembangan metode, serta pengujian kualitas bahan.

d. Spektrofotometer inframerah (IR)

Spektrofotometer inframerah mengukur interaksi radiasi inframerah dengan suatu bahan. Teknik ini terutama digunakan untuk mempelajari karakteristik vibrasi ikatan kimia dan membantu mengidentifikasi gugus fungsi atau karakteristik molekul.

Spektrofotometri IR memiliki prinsip dan bidang penggunaan yang berbeda dari spektrofotometri UV-Vis rutin di laboratorium kimia klinik.

Rentang panjang gelombang UV, cahaya tampak, dan inframerah beserta penggunaannya dibahas dalam referensi Farmakope Kementerian Kesehatan RI.

4.2 Berdasarkan sistem optik

a. Single-beam spectrophotometer

Pada sistem single-beam, cahaya melewati satu jalur pengukuran. Blanko atau larutan referensi dan sampel diukur secara bergantian untuk mengoreksi pengaruh pelarut, reagen, dan komponen optik sesuai rancangan metode.

Keunggulannya adalah konstruksi sistem optik relatif sederhana. Namun, perubahan intensitas sumber cahaya dari waktu ke waktu dapat memengaruhi pengukuran apabila tidak dikendalikan.

b. Double-beam spectrophotometer

Pada sistem double-beam, cahaya dibagi menjadi jalur sampel dan jalur referensi. Perbandingan kedua jalur tersebut dapat digunakan untuk mengoreksi perubahan intensitas sumber cahaya dan mengurangi pengaruh variasi tertentu selama pengukuran.

Desain single-beam dan double-beam memiliki karakteristik serta kebutuhan pemeliharaan berbeda. Sistem double-beam tidak otomatis lebih akurat pada setiap kondisi karena hasil tetap bergantung pada kualitas instrumen, metode, dan pengendalian mutu.

4.3 Berdasarkan cara pengukuran

Spektrofotometer juga dapat dibedakan menjadi instrumen dengan pengukuran pada panjang gelombang tetap atau instrumen pemindai spektrum (scanning spectrophotometer).

Pada pengukuran panjang gelombang tetap, alat membaca sampel pada panjang gelombang yang telah ditentukan oleh metode.

Pada pengukuran scanning, instrumen mengukur absorbansi pada sejumlah panjang gelombang dalam rentang tertentu sehingga menghasilkan spektrum serapan.

Pengukuran scanning umumnya berguna untuk karakterisasi bahan atau pengembangan metode, sedangkan panjang gelombang tetap banyak digunakan untuk analisis rutin.

5. Komponen Utama Spektrofotometer

Secara umum, spektrofotometer memiliki beberapa komponen utama yang bekerja bersama untuk menghasilkan pengukuran.

5.1 Sumber cahaya (light source)

Sumber cahaya menghasilkan radiasi yang digunakan untuk menyinari sampel.

Jenis sumber cahaya bergantung pada rentang panjang gelombang dan desain instrumen. Pada spektrofotometer UV-Vis, lampu deuterium sering digunakan untuk daerah ultraviolet, sedangkan lampu tungsten-halogen umum digunakan untuk daerah tampak dan sebagian daerah inframerah dekat.

Instrumen tertentu menggunakan sumber cahaya lain sesuai kebutuhan teknisnya.

Kualitas dan kestabilan sumber cahaya memengaruhi intensitas radiasi yang tersedia. Penurunan intensitas atau perubahan karakteristik lampu dapat memengaruhi kestabilan hasil pengukuran.

5.2 Monokromator

Monokromator merupakan komponen optik yang berfungsi memilih rentang panjang gelombang tertentu dari cahaya sumber.

Komponen ini dapat menggunakan prisma atau kisi difraksi (diffraction grating), bergantung pada desain alat.

Cahaya yang awalnya terdiri dari berbagai panjang gelombang dipisahkan sehingga bagian yang diinginkan dapat digunakan untuk pengukuran sampel.

Ketepatan pemilihan panjang gelombang sangat penting karena perubahan panjang gelombang dapat mengubah besarnya absorbansi suatu zat.

5.3 Celah optik (slit)

Celah optik membantu membatasi berkas cahaya yang masuk dan keluar dari sistem pemilih panjang gelombang.

Lebar celah turut menentukan lebar pita spektral yang diteruskan. Lebar pita spektral dapat memengaruhi kemampuan instrumen membedakan karakteristik penyerapan yang berdekatan.

5.4 Kompartemen sampel dan kuvet

Kompartemen sampel adalah bagian tempat kuvet atau wadah sampel ditempatkan pada jalur cahaya.

Kuvet berfungsi menampung larutan yang akan diukur. Kuvet dapat dibuat dari kuarsa, kaca, atau plastik khusus sesuai rentang panjang gelombang, jenis pelarut, dan persyaratan metode.

Kuvet kuarsa lazim digunakan untuk pengukuran UV. Kuvet kaca atau plastik tertentu dapat digunakan untuk pengukuran visible jika kompatibel dengan metode yang digunakan.

Kebersihan kuvet sangat penting. Sidik jari, goresan, tetesan cairan, endapan, dan gelembung udara dapat mengganggu jalur cahaya serta menyebabkan hasil pengukuran tidak konsisten.

5.5 Detektor

Detektor menangkap cahaya yang diteruskan oleh sampel dan mengubahnya menjadi sinyal listrik.

Jenis detektor yang digunakan dapat berupa fotodioda, photomultiplier tube (PMT), atau detektor berbasis susunan elemen seperti diode array, bergantung pada desain instrumen.

Sinyal yang dihasilkan dipengaruhi oleh jumlah cahaya yang diterima. Sinyal tersebut kemudian diproses secara elektronik untuk menghitung nilai absorbansi atau parameter lain yang dibutuhkan.

5.6 Sistem elektronik dan pengolah data

Sistem elektronik mengolah sinyal detektor, melakukan perhitungan, dan menampilkan hasil pada layar atau perangkat lunak.

Fungsinya dapat mencakup pengaturan panjang gelombang, pengukuran absorbansi, pengolahan spektrum, penyimpanan data, serta perhitungan konsentrasi berdasarkan persamaan atau kurva kalibrasi.

Pada alat yang lebih sederhana, hasil ditampilkan dalam bentuk absorbansi atau transmitansi. Pada instrumen yang dilengkapi perangkat lunak analisis, data dapat diproses lebih lanjut sesuai metode yang digunakan.

5.7 Sistem pengendali suhu, mekanik, dan catu daya

Komponen pendukung dapat mencakup catu daya, sistem ventilasi, kipas, mekanisme pemindah sampel, dan pengendali suhu.

Tidak semua spektrofotometer memiliki pengendali suhu atau mekanisme otomatis. Pada alat yang dilengkapi fitur tersebut, kestabilan suhu dan fungsi mekanik membantu menjaga konsistensi pengukuran sesuai kebutuhan analisis.

6. Alur Kerja Pengukuran Spektrofotometri

Urutan kerja dapat berbeda sesuai tipe alat. Namun, secara umum prosesnya adalah sebagai berikut.

Tahap 1: Persiapan instrumen

Instrumen ditempatkan pada permukaan yang stabil, dengan kondisi lingkungan dan kelistrikan sesuai petunjuk produsen. Periksa kondisi fisik alat, kompartemen sampel, serta status operasionalnya.

Tahap 2: Menyalakan alat dan menunggu kestabilan

Nyalakan instrumen dan lakukan waktu pemanasan (warm-up) jika dipersyaratkan oleh produsen. Waktu pemanasan yang diperlukan tidak selalu sama pada setiap model.

Tahap 3: Menentukan metode dan panjang gelombang

Pilih metode pemeriksaan, panjang gelombang, serta parameter lain sesuai prosedur analisis. Pada analisis yang memerlukan spektrum, lakukan pemindaian sesuai metode.

Tahap 4: Menyiapkan blanko atau referensi

Blanko digunakan untuk memperhitungkan kontribusi pelarut, reagen, dan komponen lain yang tidak menjadi sasaran pengukuran. Pada analisis kimia klinik, jenis blanko yang digunakan harus mengikuti metode reagen dan prosedur alat.

Tahap 5: Menyiapkan sampel

Pastikan sampel dan reagen memenuhi persyaratan metode. Sampel harus ditangani secara benar, dan kuvet harus bersih serta bebas dari gelembung atau kontaminasi yang dapat mengganggu pengukuran.

Tahap 6: Memasukkan kuvet

Tempatkan kuvet pada posisi yang benar. Hindari menyentuh bagian optik kuvet dan pastikan orientasinya sesuai petunjuk instrumen.

Tahap 7: Mengukur sampel

Jalankan pengukuran dan biarkan alat membaca intensitas cahaya yang diteruskan oleh sampel. Instrumen menghitung nilai absorbansi atau parameter optik lainnya.

Tahap 8: Menghitung dan mengevaluasi hasil

Hasil dapat dihitung berdasarkan hukum Lambert-Beer, persamaan kalibrasi, atau kurva standar. Untuk pemeriksaan laboratorium, hasil juga harus dievaluasi bersama hasil kalibrasi dan kontrol mutu yang berlaku.

Tahap 9: Membersihkan dan menyimpan alat

Setelah pemeriksaan selesai, keluarkan sampel dan bersihkan bagian yang memang diperbolehkan oleh prosedur. Simpan instrumen sesuai petunjuk produsen dan dokumentasikan penggunaan atau masalah yang ditemukan jika diperlukan.

7. Metode Pemeriksaan Berbasis Fotometri di Laboratorium Kimia Klinik

Dalam laboratorium kimia klinik, fotometri banyak digunakan untuk mengukur perubahan absorbansi yang berhubungan dengan reaksi kimia atau reaksi enzimatik. Metode yang digunakan bergantung pada analit, komposisi reagen, panjang gelombang, dan karakteristik reaksi.

7.1 Metode endpoint

Pada metode endpoint, hasil dibaca setelah reaksi mencapai tahap akhir yang ditentukan oleh metode pemeriksaan.

Secara sederhana, sampel dicampur dengan reagen dan dibiarkan bereaksi sesuai waktu serta kondisi yang telah ditetapkan. Setelah tahap akhir tercapai, absorbansi diukur dan digunakan untuk menentukan konsentrasi analit.

Contoh penggunaan dapat ditemukan pada pemeriksaan yang menghasilkan senyawa berwarna stabil, seperti beberapa metode pemeriksaan glukosa, kolesterol, atau protein.

Namun, tidak semua metode untuk analit tersebut menggunakan reaksi endpoint yang sama.

7.2 Metode kinetik

Pada metode kinetik, alat mengukur perubahan absorbansi secara berulang selama periode tertentu.

Perubahan absorbansi terhadap waktu digunakan untuk menghitung laju reaksi. Dalam pemeriksaan enzim, laju perubahan tersebut dapat berkaitan dengan aktivitas enzim dalam sampel.

Sebagai contoh, pemeriksaan AST dan ALT dengan metode enzimatik tertentu memantau perubahan NADH atau NADPH pada panjang gelombang yang sesuai. Besarnya perubahan absorbansi per satuan waktu diolah menjadi aktivitas enzim sesuai persamaan metode.

Metode kinetik memerlukan kestabilan waktu, suhu, panjang gelombang, serta kondisi reaksi agar hasilnya dapat dipercaya.

7.3 Metode fixed-time

Metode fixed-time mengukur perubahan absorbansi pada interval waktu yang telah ditentukan. Hasil dapat diperoleh dari selisih absorbansi pada dua atau lebih titik waktu sesuai metode.

Metode ini berbeda dari endpoint karena fokus pengukurannya berada pada perubahan selama interval yang ditetapkan, bukan hanya nilai akhir reaksi.

7.4 Metode dua panjang gelombang atau bichromatic

Pada sistem bichromatic, pengukuran menggunakan panjang gelombang utama dan panjang gelombang pembanding.

Sinyal dari dua panjang gelombang tersebut dapat dikombinasikan untuk mengurangi pengaruh gangguan tertentu, misalnya sebagian latar belakang optik atau variasi nonspesifik, apabila karakteristik gangguannya sesuai dengan rancangan metode.

Efektivitas koreksi bergantung pada panjang gelombang yang digunakan dan sifat sampel. Metode ini tidak menghilangkan semua jenis interferensi secara otomatis.

7.5 Metode kolorimetri

Kolorimetri merupakan pendekatan pengukuran yang berfokus pada intensitas warna atau penyerapan cahaya tampak.

Dalam pemeriksaan kimia klinik, kolorimetri sering melibatkan reaksi kimia yang menghasilkan senyawa berwarna. Instrumen mengukur intensitas penyerapan pada panjang gelombang tertentu, kemudian hasil digunakan untuk menentukan kadar analit.

Kolorimetri dan spektrofotometri berhubungan erat, tetapi istilahnya tidak selalu dapat dipertukarkan untuk setiap metode. Spektrofotometri memiliki cakupan lebih luas karena dapat mengukur serapan pada daerah ultraviolet dan inframerah, selain cahaya tampak.

7.6 Turbidimetri

Turbidimetri mengukur penurunan intensitas cahaya yang diteruskan akibat hamburan oleh partikel dalam suspensi.

Metode ini dapat digunakan pada pemeriksaan yang membentuk kompleks atau partikel, termasuk beberapa pemeriksaan protein berdasarkan pembentukan kompleks imun.

Walaupun sama-sama menggunakan prinsip optik, turbidimetri tidak identik dengan pengukuran absorbansi molekuler berdasarkan hukum Lambert-Beer. Mekanisme pelemahan cahaya akibat hamburan perlu diperhitungkan.

Pembahasan mengenai perbedaan spektrofotometri serapan, turbidimetri, nefelometri, dan teknik optik lainnya tersedia dalam Farmakope Kementerian Kesehatan RI.

8. Penerapan Spektrofotometer di Laboratorium Kesehatan

Prinsip spektrofotometri memiliki peran penting dalam berbagai pemeriksaan kimia klinik. Pada chemistry analyzer, sistem fotometri digunakan untuk mendeteksi perubahan penyerapan cahaya akibat reaksi sampel dan reagen.

Beberapa contoh pemeriksaan yang dapat menggunakan metode berbasis fotometri adalah sebagai berikut.

8.1 Pemeriksaan glukosa

Pada metode tertentu, glukosa bereaksi melalui sistem enzimatik dan menghasilkan produk yang dapat diukur secara fotometri. Intensitas warna atau perubahan sinyal optik kemudian digunakan untuk menghitung konsentrasi glukosa dengan bantuan kalibrator atau kurva kalibrasi.

Metode yang berbeda dapat menghasilkan panjang gelombang dan karakteristik reaksi yang berbeda pula.

8.2 Pemeriksaan kolesterol total

Beberapa metode pemeriksaan kolesterol menggunakan reaksi enzimatik yang menghasilkan senyawa berwarna. Besarnya absorbansi produk reaksi kemudian digunakan untuk menentukan kadar kolesterol.

8.3 Pemeriksaan trigliserida

Metode trigliserida yang umum digunakan pada chemistry analyzer melibatkan serangkaian reaksi enzimatik. Produk akhir pada metode tertentu menghasilkan perubahan warna yang dapat diukur oleh sistem fotometri.

8.4 Pemeriksaan kreatinin

Kreatinin dapat diperiksa dengan metode yang berbeda, termasuk metode Jaffe dan metode enzimatik. Pada metode Jaffe, reaksi dengan pikrat dalam kondisi basa menghasilkan perubahan warna yang diukur secara fotometri.

Hasil pemeriksaan dapat dipengaruhi oleh zat pengganggu tertentu. Karena itu, interpretasi hasil perlu mempertimbangkan prinsip metode dan keterbatasan reagen yang digunakan.

8.5 Pemeriksaan ureum

Pada metode enzimatik tertentu, ureum diuraikan melalui reaksi yang melibatkan enzim urease dan dilanjutkan dengan reaksi indikator. Produk reaksi kemudian diukur melalui sistem optik sesuai metode yang digunakan.

8.6 Pemeriksaan asam urat

Pemeriksaan asam urat dapat menggunakan reaksi enzimatik, misalnya melalui urikase, yang dilanjutkan dengan pembentukan produk yang dapat dideteksi secara fotometri. Karakteristik pengukuran bergantung pada sistem reaksi yang digunakan.

8.7 Pemeriksaan AST dan ALT

AST dan ALT merupakan enzim yang aktivitasnya dapat diperiksa dengan metode kinetik. Pada metode tertentu, reaksi yang terhubung dengan NADH dipantau melalui perubahan absorbansi pada panjang gelombang yang sesuai.

Karena hasil didasarkan pada laju reaksi, waktu pengukuran, suhu, serta kondisi reagen sangat penting dalam pemeriksaan ini.

8.8 Pemeriksaan bilirubin, albumin, dan protein total

Beberapa metode pemeriksaan bilirubin, albumin, dan protein total menggunakan reaksi yang menghasilkan perubahan warna atau perubahan penyerapan cahaya.

Pemilihan reagen, panjang gelombang, dan teknik perhitungan mengikuti prinsip metode masing-masing.

Catatan penting: contoh di atas bukan berarti seluruh pemeriksaan tersebut selalu dilakukan menggunakan satu metode atau satu panjang gelombang yang sama. Laboratorium harus mengikuti metode tervalidasi dan petunjuk penggunaan reagen yang kompatibel dengan instrumen.

9. Perbedaan Spektrofotometer dengan Chemistry Analyzer

Meskipun memiliki dasar prinsip optik yang berkaitan, spektrofotometer dan chemistry analyzer memiliki fungsi serta cakupan sistem yang berbeda.

Aspek

Spektrofotometer

Chemistry analyzer

Fungsi utama

Mengukur karakteristik optik sampel

Melakukan pemeriksaan kimia klinik secara manual atau otomatis sesuai desain alat

Sistem sampel

Umumnya menggunakan kuvet atau wadah khusus

Dapat menggunakan tabung sampel, kuvet reaksi, atau sistem reaksi terintegrasi

Penambahan reagen

Umumnya disiapkan oleh operator atau sistem eksternal

Dapat dilakukan secara otomatis pada alat otomatis

Pengukuran

Absorbansi, transmitansi, atau spektrum sesuai kemampuan alat

Dapat menggunakan fotometri, turbidimetri, ISE, atau metode lainnya

Pengolahan data

Berdasarkan metode analisis yang dipilih

Terintegrasi dengan program pemeriksaan, kalibrasi, kontrol mutu, dan laporan hasil

Penggunaan

Penelitian, analisis bahan, dan berbagai pemeriksaan laboratorium

Pemeriksaan rutin kimia klinik dengan tingkat otomatisasi sesuai model

Pada chemistry analyzer, sistem fotometri dapat menjadi salah satu modul penting, tetapi bukan satu-satunya teknologi yang mungkin digunakan. Sebagai contoh, pemeriksaan elektrolit pada sejumlah chemistry analyzer menggunakan metode ion-selective electrode (ISE), bukan pengukuran absorbansi biasa.

10. Faktor yang Memengaruhi Hasil Pengukuran

Keakuratan spektrofotometri tidak hanya bergantung pada spesifikasi alat. Kondisi sampel, reagen, teknik pengukuran, serta pengendalian mutu juga memengaruhi hasil.

10.1 Ketepatan panjang gelombang

Apabila instrumen tidak memilih panjang gelombang yang sesuai, absorbansi yang terbaca dapat berbeda dari nilai yang diharapkan. Pemeriksaan ketepatan panjang gelombang harus dilakukan berdasarkan spesifikasi instrumen dan prosedur verifikasi yang berlaku.

10.2 Kestabilan sumber cahaya

Intensitas sumber cahaya yang berubah dapat menimbulkan variasi hasil, terutama jika sistem tidak dapat mengoreksi perubahan tersebut dengan memadai.

10.3 Kondisi kuvet

Kuvet yang kotor, tergores, retak, atau memiliki sisa cairan dapat mengubah jalur cahaya. Orientasi kuvet yang tidak konsisten juga dapat menimbulkan variasi pengukuran pada jenis kuvet tertentu.

10.4 Gelembung udara dan partikel

Gelembung udara, endapan, partikel, atau kekeruhan dapat mengganggu transmisi cahaya. Pada sampel biologis, kondisi tersebut perlu dinilai sesuai persyaratan metode.

10.5 Reagen dan kondisi reaksi

Reagen yang kedaluwarsa, disimpan tidak sesuai petunjuk, terkontaminasi, atau dipersiapkan dengan tidak tepat dapat menghasilkan reaksi yang tidak optimal.

Untuk metode enzimatik, perubahan suhu dan waktu inkubasi juga dapat memengaruhi laju reaksi serta nilai pengukuran.

10.6 Karakteristik sampel

Hemolisis, lipemia, ikterus, dan berbagai gangguan matriks dapat memengaruhi sebagian metode pemeriksaan kimia klinik. Pengaruhnya bergantung pada analit dan prinsip reagen.

Interferensi tersebut tidak selalu dapat diselesaikan hanya dengan mengubah panjang gelombang. Laboratorium harus mengikuti batas interferensi yang disediakan produsen reagen atau metode tervalidasi.

10.7 Cahaya liar (stray light)

Cahaya liar adalah radiasi yang mencapai detektor pada panjang gelombang yang tidak diinginkan atau tidak sesuai dengan pengukuran yang seharusnya.

Keberadaan cahaya liar dapat menimbulkan kesalahan pada hasil absorbansi, terutama ketika sampel mempunyai absorbansi tinggi. Karena itu, pemeriksaan kinerja optik merupakan bagian penting dari evaluasi instrumen.

Pembahasan ilmiah mengenai ketepatan panjang gelombang, linearitas fotometrik, cahaya liar, serta sumber kesalahan pengukuran dapat dibaca dalam artikel Errors in Spectrophotometry and Calibration Procedures to Avoid Them.

11. Kalibrasi, Verifikasi, dan Pengendalian Mutu

Agar hasil pengukuran dapat dipercaya, spektrofotometer dan sistem pemeriksaan yang menggunakannya harus memenuhi persyaratan kinerja yang ditetapkan.

11.1 Kalibrasi

Kalibrasi merupakan kegiatan yang menghubungkan hasil pengukuran instrumen dengan nilai acuan melalui hubungan yang ditetapkan, disertai ketidakpastian pengukurannya sesuai prosedur kalibrasi.

Pada pemeriksaan kimia klinik, istilah kalibrasi juga digunakan untuk proses penetapan hubungan antara respons instrumen dan konsentrasi analit dengan menggunakan kalibrator sesuai metode.

Kedua penggunaan istilah tersebut harus dipahami berdasarkan konteksnya. Kalibrasi sistem analitik tidak selalu berarti seluruh bagian optik instrumen disetel ulang.

11.2 Verifikasi kinerja fotometrik

Verifikasi bertujuan memeriksa apakah kinerja instrumen memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan.

Parameter yang dapat diperiksa sesuai jenis alat antara lain:

Ketepatan panjang gelombang: menilai kesesuaian panjang gelombang yang dibaca instrumen terhadap nilai acuan.

Ketepatan fotometrik: menilai kesesuaian hasil absorbansi atau transmitansi terhadap nilai standar.

Presisi atau keterulangan: menilai konsistensi hasil pengukuran berulang.

Linearitas fotometrik: memeriksa kesesuaian hubungan respons fotometrik pada rentang tertentu.

Cahaya liar: menilai kontribusi cahaya yang tidak seharusnya terukur.

Stabilitas pembacaan: mengevaluasi kestabilan sinyal selama periode pengamatan.

Parameter dan batas penerimaan harus ditentukan berdasarkan spesifikasi pabrikan, kebutuhan metode, standar yang digunakan, dan prosedur laboratorium. Contoh parameter spesifikasi instrumen dapat dilihat pada Assay Guidance Manual di NCBI Bookshelf.

11.3 Kalibrator dan kontrol mutu

Kalibrator digunakan untuk menetapkan atau menyesuaikan hubungan antara respons sistem dan konsentrasi analit.

Bahan kontrol mutu atau quality control (QC) digunakan untuk menilai apakah sistem pemeriksaan bekerja secara konsisten dan memenuhi kriteria penerimaan.

Kalibrator dan bahan QC memiliki fungsi berbeda. Hasil kalibrasi yang dapat diterima tidak menggantikan kebutuhan menjalankan QC sesuai prosedur laboratorium.

Pada chemistry analyzer, QC biasanya dilakukan menggunakan bahan kontrol dengan nilai atau rentang penerimaan yang telah ditetapkan. Hasil QC harus dievaluasi sebelum hasil pasien dirilis sesuai kebijakan laboratorium.

12. Pemeliharaan Spektrofotometer

Pemeliharaan diperlukan untuk menjaga kebersihan, stabilitas operasional, dan kinerja instrumen. Jenis serta frekuensi pemeliharaan harus mengikuti manual produsen dan prosedur laboratorium.

12.1 Pemeliharaan harian atau sebelum penggunaan

Pemeriksaan awal dapat mencakup:

Memeriksa kondisi fisik instrumen dan kabel daya.

Memastikan kompartemen sampel bersih dan tidak terdapat tumpahan.

Memeriksa kondisi kuvet yang digunakan.

Menjalankan pemanasan atau pemeriksaan awal sesuai petunjuk alat.

Memeriksa blanko, standar, atau QC bila dipersyaratkan oleh metode.

12.2 Pemeliharaan berkala

Pemeliharaan berkala dapat mencakup pembersihan sesuai prosedur, pemeriksaan sistem optik, evaluasi kondisi sumber cahaya, pemeriksaan mekanisme pemegang kuvet, serta verifikasi kinerja alat.

Penggantian lampu tidak harus dilakukan pada satu interval yang sama untuk semua instrumen. Keputusan penggantian perlu mempertimbangkan umur pakai, jam penggunaan, indikator kinerja, dan rekomendasi produsen.

12.3 Penanganan kuvet

Kuvet perlu dibersihkan dengan bahan yang kompatibel dengan jenis kuvet dan pelarut yang digunakan. Setelah dibersihkan, kuvet harus ditangani agar tidak meninggalkan sidik jari atau residu pada permukaan optiknya.

Kuvet yang telah tergores, retak, atau mengalami perubahan yang mengganggu transmisi cahaya perlu dievaluasi dan diganti bila diperlukan.

12.4 Keselamatan saat pemeliharaan

Pembersihan dan pemeriksaan rutin harus mengikuti prosedur keselamatan laboratorium. Instrumen harus dimatikan atau diputus dari sumber daya apabila prosedur mengharuskannya.

Pembongkaran rumah instrumen, perbaikan rangkaian elektronik, penyetelan optik internal, atau penggantian komponen yang memerlukan akses servis sebaiknya dilakukan oleh teknisi yang kompeten sesuai petunjuk produsen.

12.5 Dokumentasi pemeliharaan

Setiap kegiatan pemeliharaan, perbaikan, verifikasi, atau penggantian komponen perlu dicatat sesuai sistem dokumentasi laboratorium.

Dokumentasi yang baik membantu menelusuri riwayat gangguan, mengevaluasi perubahan kinerja, dan menentukan tindak lanjut apabila hasil pengukuran tidak memenuhi persyaratan.

13. Gangguan Umum dan Penanganan Awal

Gejala

Kemungkinan penyebab

Tindak lanjut awal

Hasil absorbansi tidak stabil

Sumber cahaya belum stabil, kuvet kotor, gelembung, atau gangguan pada alat

Periksa waktu pemanasan, kondisi sampel, kebersihan kuvet, dan ulangi pengukuran sesuai prosedur

Nilai blanko tinggi

Kontaminasi blanko, kuvet kotor, pelarut atau reagen menyerap cahaya, atau masalah optik

Periksa blanko, reagen, kuvet, dan persyaratan panjang gelombang

Hasil berbeda dari yang diharapkan

Kesalahan persiapan sampel, metode tidak sesuai, interferensi, kalibrasi bermasalah, atau kinerja instrumen berubah

Periksa prosedur, reagen, QC, dan status verifikasi alat

Intensitas cahaya rendah

Sumber cahaya menurun, jalur cahaya terhalang, atau masalah detektor

Periksa kondisi operasional dan lakukan pemeriksaan teknis sesuai manual

Hasil QC di luar rentang

Masalah reagen, kalibrasi, sampel kontrol, suhu, atau sistem pengukuran

Tahan rilis hasil terkait dan lakukan investigasi sesuai SOP

Pembacaan antarulangan tidak konsisten

Penanganan kuvet berbeda, sampel tidak homogen, gelembung, atau variasi waktu reaksi

Periksa homogenitas, konsistensi pengukuran, dan prosedur reaksi

Tabel tersebut merupakan panduan pemeriksaan awal, bukan pengganti prosedur pemecahan masalah khusus dari produsen. Jika hasil tetap tidak memenuhi persyaratan, instrumen dan sistem pemeriksaan perlu dievaluasi lebih lanjut oleh personel yang berwenang.

14. Kelebihan dan Keterbatasan Spektrofotometer

14.1 Kelebihan

a. Pengukuran objektif

Alat mengukur sinyal optik secara instrumental sehingga hasil tidak hanya bergantung pada persepsi visual pengamat terhadap warna.

b. Dapat digunakan untuk analisis kuantitatif

Dengan metode, blanko, dan kalibrasi yang tepat, nilai absorbansi dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi zat.

c. Fleksibel

Spektrofotometer dapat digunakan untuk berbagai jenis sampel dan tujuan analisis sepanjang karakteristiknya sesuai dengan spesifikasi instrumen.

d. Mendukung pengembangan metode

Instrumen yang dapat melakukan scanning membantu peneliti mempelajari spektrum serapan dan menentukan kondisi pengukuran yang sesuai.

e. Dapat diintegrasikan dalam sistem otomatis

Prinsip fotometri dapat digabungkan ke dalam chemistry analyzer untuk mendukung pengukuran banyak sampel secara lebih efisien.

14.2 Keterbatasan

a. Membutuhkan metode yang sesuai

Tidak semua zat dapat diukur secara langsung melalui serapan cahaya. Sebagian memerlukan reaksi kimia atau enzimatik agar menghasilkan sinyal yang dapat diukur.

b. Dapat mengalami interferensi

Zat lain dalam sampel dapat menyerap atau menghamburkan cahaya sehingga memengaruhi hasil.

c. Memerlukan kondisi optik yang baik

Kuvet yang kotor, sumber cahaya yang tidak stabil, ketidaktepatan panjang gelombang, dan cahaya liar dapat menurunkan kualitas hasil.

d. Memiliki rentang linear tertentu

Hubungan absorbansi dan konsentrasi tidak selalu linear pada semua rentang konsentrasi. Sampel yang berada di luar rentang kerja metode perlu ditangani sesuai prosedur yang tervalidasi.

e. Tidak semua metode cocok untuk semua instrumen

Jenis kuvet, rentang panjang gelombang, lebar pita spektral, dan karakteristik detektor dapat membatasi jenis pemeriksaan yang bisa dilakukan.

15. Perkembangan dan Peran Spektrofotometri dalam Teknologi Laboratorium

Spektrofotometri masih memiliki peran penting dalam analisis modern karena prinsipnya dapat diterapkan pada instrumen sederhana hingga sistem analitik otomatis.

Pada instrumen mandiri, spektrofotometri memungkinkan pengguna mempelajari karakteristik optik sampel, melakukan analisis kuantitatif, dan mengembangkan metode baru.

Pada chemistry analyzer otomatis, prinsip fotometri diintegrasikan dengan sistem penanganan sampel, reagen, pengaturan suhu, pengukuran berulang, serta perangkat lunak pengolahan hasil. Integrasi ini mendukung efisiensi pemeriksaan dan konsistensi proses, tetapi tetap membutuhkan kalibrasi, QC, pemantauan kinerja, serta pemeliharaan yang tepat.

Perkembangan detektor, sistem optik, dan perangkat lunak juga mendukung pengukuran dengan lebih banyak panjang gelombang serta pemrosesan data yang lebih baik. Meskipun teknologi terus berkembang, keabsahan hasil tetap bergantung pada kesesuaian metode, mutu bahan, kondisi sampel, dan kinerja instrumen.

16. Kesimpulan

Spektrofotometer adalah instrumen analisis yang mengukur karakteristik interaksi cahaya dengan suatu sampel, terutama melalui pengukuran absorbansi atau transmitansi pada panjang gelombang tertentu. Dalam analisis serapan, prinsip kuantitatifnya berkaitan dengan hukum Lambert-Beer, yang menjelaskan hubungan antara absorbansi, konsentrasi zat penyerap, dan panjang lintasan optik dalam kondisi yang sesuai.

Komponen utama spektrofotometer mencakup sumber cahaya, monokromator, celah optik, kompartemen sampel, kuvet, detektor, dan sistem elektronik. Setiap komponen memiliki peran dalam menghasilkan sinyal pengukuran yang dapat diolah menjadi informasi analitis.

Dalam laboratorium kesehatan, prinsip fotometri digunakan secara luas pada pemeriksaan kimia klinik, antara lain melalui metode endpoint, kinetik, fixed-time, dan kolorimetri. Namun, metode dan panjang gelombang harus disesuaikan dengan karakteristik analit, reagen, serta prosedur pemeriksaan yang digunakan.

Agar hasil pengukuran dapat dipercaya, diperlukan penanganan sampel yang benar, kebersihan kuvet, kondisi instrumen yang baik, kalibrasi dan verifikasi yang sesuai, pelaksanaan QC, serta dokumentasi dan pemeliharaan berkala.

Dengan memahami prinsip dan cara kerja spektrofotometer secara menyeluruh, pengguna laboratorium dapat mengoperasikan instrumen dengan lebih tepat, mengenali faktor yang berpotensi menyebabkan kesalahan, dan mendukung tersedianya hasil pemeriksaan yang akurat serta dapat diandalkan.